研究 | Nature：人类微生物组序列抗糖尿病药物阿卡波糖的耐药性

断定的Maks(pMaks)的未有经试验的胺基酸（平面图1b）。几周，常用MetaBGC（深入研究方法），我们监测了来自所有主要肌肉手部（脾道、黏膜、指甲和阴囊）和五个国家（美国、之以前国、丹麦、西班牙和毛里求斯）的3212份样品之以前mak和pmak基因组的注记达。除此以外的是，13个mak和pmak基因组在黏膜样品之以前相当普遍（249/264，占HMP旁观者的94%，144/243，占毛里求斯旁观者的59%，在其黏膜样品之以前区块有数一个mak或pmak基因组），更是是在舌根上菌斑样品之以前（229/230，占HMP旁观者的99%）。

性状黏膜mak和pmak基因组的风行不下并不相同很小（黏膜样品之以前HMP旁观者的8%至81%），其之以前mak1栖息于最广（213/264，81%的HMP旁观者）且最独特（平面图1d、扩大图注记平面图4和必需注记2）。从剥离的基因组小组之以前推测的黏膜mak和pmak基因组由噬菌体道门（如噬菌体）、交接处菌道门（如Solobacterium moorei）和利杆菌道门（如Leptotrichia trevisanii）之以前的多种生；也体区块，根据祥基因组小组图注记具体的mak和pmak基因组预期来自相近的3个道门（平面图1b和必需注记1）。 虽然在脾道有机体小组之以前常常可以监测到几种口服mak和pmak基因组，但只有一种基因组——mak16，由脾道噬交接处菌区块，有数在脾道之以前推测（25/301，占HMP旁观者的8%；7/194，占之以前国人的4%；21/193，占Fijicomp的11%；34/318，占MetaHit的11%）。最终，我们深入研究了几个公开的激活小组图注记集，并监测到有数两个并不相同性状的黏膜有机体小组样品之以前12个mak和pmak基因组与尿液有机体小组样品之以前一个基因组（mak16）匹配的激活小组温度计（深入研究方法和必需注记2）。综上所述，这些深入研究注记明日尔曼波蔗糖失活丝氨酸体的同系；也广泛长期存在于并不相同老年人的黏膜和脾道有机体群之以前。

平面图1. 从本能有机体小组之以前推测Maks的祥基因组小组学。a，日尔曼波蔗糖BGC（acb）（顶部）。顶部，AcbK细胞内日尔曼波蔗糖以造成了日尔曼波蔗糖-O6A-硫。b，本研究之以前推测的AcbK相合；也的最大似然分子生；也学榕，常用MEGA7实现（供参考42），在自成点看出的1000个单调之以前，引导值>50%。该榕之外先以前注记征的日尔曼波蔗糖激丝氨酸体（金色）、来自大脾杆菌的PfkB、经Laboratory证明的Mck具（绿色、Maks）或欠缺（蓝色）日尔曼波蔗糖-O6A-激丝氨酸体活性，以及未有经Laboratory试验的（蓝色），以及未有经Laboratory试验的（蓝色）。PMAK注记示AcbK自成之以前假定的MAK。都是生；也体的道门用边缘框注记示。星号注记示该道门是由于祥基因组小组都是而被计算的。明晰的榕如扩大图注记平面图2请注意。c，每个Laboratory注记征的Mck/Mak相比较之下AcbK的速不下，如b之以前请注意。单个单调的值（n = 2或n = 3） 看出为小圆圈。值得注意图注记方知必需注记3。扩大图注记平面图3和5之以前看出了代注记性的HPLC–MS和HPLC高分辨不下（HR）–MS/MS图注记。d，热平面图看出了五个深入研究链注记之以前mak和pmak基因组的选定子集的轻元素，这是由MetaBGC近似值的（未有看出无给定驱动器的样品）（顶部）。常用UPGMA（具乘法平除此以外值的未有量化配对小组深入研究方法）在R. Bottom的pheatmap之以前同步进行各别聚类，在HMP链注记之以前两个肌肉手部的同一小组mak和pmak基因组的患病不下（感染性性状的百份）。所有链注记之以前所有mck基因组的患病不下和轻元素如扩大图注记平面图2和必需注记2请注意。

2 Mak1和AcbK的类似于丝氨酸体；也理性质

我们促使注记征了最独特和栖息于最广的Mak，Mak1。首先，我们试验了Mak1对日尔曼波蔗糖的细胞内断言确实会造成其失活，正如AcbK报道的那样。我们常用比色法定量了AcbK或Mak1造成了的日尔曼波蔗糖及其细胞内型式对人唾液淀粉丝氨酸体和猪发挥作用淀粉丝氨酸体的抑止活性（扩大图注记平面图5）。虽然日尔曼波蔗糖在剂量为10 μM极其容易实际上抑止这两种丝氨酸体，在相近剂量下（平面图2a、b和必需注记4），两种细胞内型式（由AcbK或Mak1造成了）除此以外未有推论到抑止特异性。这些结果确认了Maks对日尔曼波蔗糖的细胞内造成其失活。其次，我们试验了日尔曼波蔗糖断言是Mak1的众所周知甘氨酸；未有知锂水化合；也激丝氨酸体细胞内本体类似于的甘氨酸。我们将Mak1和AcbK与8种并不相同的锂水化合；也和氨基蔗合成酶两兄弟幼体，并近似值它们与每种甘氨酸的推论原子化速不下。Mak1和AcbK除此以外观感出对日尔曼波蔗糖的强烈比如说，而对具体化合；也有数有数未细胞内特异性（扩大图注记平面图6）。 最终，我们还试验了Mak1细胞内日尔曼波蔗糖的丝氨酸体；也理性质断言与AcbK的丝氨酸体；也理性质类似于。我们具体日尔曼波蔗糖的注记观米氏常数（Km）对于Mak1为 424 μM，对于AcbK为428 μM（平面图2c和必需注记3），注记明日尔曼波蔗糖作为甘氨酸也有近似于的比如说。除此以外的是，Mak1的kcat（多重生成还原速不下常数）为16.4 s−1，而 AcbK 为 8.2s-1，注记明在近似于的Laboratory室前提条件下，Mak1细胞内日尔曼波蔗糖的速度比AcbK快速。在并不相同的甘氨酸剂量（平面图2c和扩大图注记平面图6）和温度（扩大图注记平面图6和必需注记3）下，相符推论到这种并不相同。此外，在实质上的ATP和日尔曼波蔗糖剂量下，丝氨酸体剂量减小100倍确实会造成AcbK的kobs差分减小100倍，而Mak1的kobs非差分减小将近1000倍。因此，Mak1是一种组织化丝氨酸体（Hill系数） = 1.71 ± 0.06），而AcbK不是（Hill = 1.13 ± 0.02）（扩大图注记平面图6和必需注记3）。这些深入研究注记明，Mak1和AcbK在甘氨酸选择性、还原活性和Km特别极其类似于，但在kcat和组织化性特别略有并不相同。平面图2. Mak1和AcbK以类似于的丝氨酸体；也理性质细胞内和灭活日尔曼波蔗糖。a，b：猪发挥作用淀粉丝氨酸体（a）和人唾液淀粉丝氨酸体（b）的比色淀粉丝氨酸体活性定量。405处吸视星等的减小 nm（y轴，每30分钟量度一次 s） 注记明寡蔗糖甘氨酸虚拟；也（亚乙基) -pNP-G7) 和浅蓝染料 (p-肼酚) 作为淀粉丝氨酸体活性的从外部寡核苷酸的释放。尽管任一淀粉丝氨酸体与10 μM日尔曼波蔗糖实际上扫除其活性，与Mak1或AcbK造成了的相近剂量的日尔曼波蔗糖-O6A-氨（Acb-O6A-P）幼体以后具抑止特异性。a和b之以前绘出的图注记来自单个Laboratory。必需注记4给出了本Laboratory和第二次单调Laboratory的值得注意图注记，看出了相近的结果。c.AcbK（灰色）和Mak1（蓝色）的Michaelis–Menten饱和曲线。Km和kcat值以各自的橙色注记示，两种丝氨酸体的实质上kobs量度单调在平面图上看出。S0为初始甘氨酸剂量，E0为丝氨酸体剂量。值得注意图注记方知必需注记3。

3 AcbK和Mak1的本体深入研究为

了了解这两种激丝氨酸体是如何识别和细胞内日尔曼波蔗糖的，我们通过X射线晶体学以2.4 Å的分辨不下定量了与日尔曼波蔗糖和非水解ATP近似于；也腺苷酸亚氨基二氨（AMP-PNP）生成的AcbK的晶体本体和分辨不下为3.1 Å的等效Mak1络合；也 Å（必需注记5）。Mak1和AcbK本体类似于（除此以外q差值 = 1.12 Å代注记272个Cα原子），具42%的核苷酸同一性，与大脾杆菌丝氨酸激丝氨酸体PfkB（胺基酸图注记库（PDB）：1RKD）具相近的整体而言卷曲。这种丝氨酸激丝氨酸体的小水分子由两个碱基小组成：一个核心α/β碱基和一个伸展N-顶端的较小的五链β-卷曲（平面图3a）。AcbK和Mak1通过五链β-片的二聚特异性在晶体之以前成改型同改型单体，成改型“β-扣马蹄形”，其包涵Mak1之以前的甘氨酸13-41和93-113，以及AcbK之以前的甘氨酸14-42和94-115（平面图3b和扩大图注记平面图7）。β-马蹄形扣内多肽链间的相互特异性广泛，略高于1298个 Å2的注记面积，成改型一个小的疏水核。β-马蹄形扣内的每个β-片包涵来自单体之以前两个小水分子的β-链，更是是一个小水分子的β3与另一个小水分子的β8（平面图3b和扩大图注记平面图7）。β-卡马蹄形还成改型日尔曼波蔗糖生成亚基的一面，来自一个小水分子的β3与同改型单体之以前另一个小水分子的活性亚基的边缘带入，成改型日尔曼波蔗糖生成亚基上盖住的一部份（平面图3b和扩大图注记平面图7）。忽略，由AMP-PNP占优势的ATP生成亚基实际上包涵在每个小水分子之以前。 日尔曼波蔗糖甘氨酸在β-马蹄形和α/β碱基间成改型的丝氨酸激丝氨酸体卷曲裂缝内以延展过渡态生成。每个日尔曼波蔗糖水分子可埋藏多达501Å2的一个小水分子注记面积和94 Å2在每个单体之以前的另一个小水分子上。日尔曼波蔗糖的日尔曼维菌素部份（A和B马蹄形；平面图1a）并不相同于具体低聚蔗糖，并在日尔曼波蔗糖和激丝氨酸体间造成了最广泛的相互特异性。A马蹄形上的每个烷基与AcbK:Ser109上的甘氨酸成改型共价键，与日尔曼波蔗糖O2A成改型共价键；含O3A的Asn99；Asp16与O4A；以及近似于O6A的Asp248（扩大图注记平面图7）；Mak1之以前分别有Ser108、Asn98、Asp15和Asp247（平面图3c）。这些共价键甘氨酸在所有试验和确认的MAK之以前都是保守的，确实对有利于日尔曼波蔗糖A马蹄形很重要（平面图3d和扩大图注记平面图7）。日尔曼波蔗糖B马蹄形和激丝氨酸体间的相互特异性涉及两个共价键：日尔曼波蔗糖O2B与AcbK之以前的Asn165和Ser31（Mak1之以前的Asn163和Ser30），并由单体之以前的两个小水分子贡献，马蹄形夹在芳香侧链的注记面间：AcbK之以前的Trp111和His164，或Mak1之以前的Tyr110和His162。与马蹄形A和马蹄形B忽略，马蹄形A和马蹄形B牢牢地实质上在活性亚基裂口的最深部份，马蹄形C和马蹄形D位于裂口的较粗地带，与胺基酸欠缺共价键（平面图3c和扩大图注记平面图7）；因此，日尔曼波蔗糖激丝氨酸体的甘氨酸特异性主要缺少于与独特的日尔曼维辛部份的相互特异性。

在PfkB之以前，丝氨酸细胞内的拟定前提是通过丝氨酸的O5′烷基脱原子，引发它对ATP33的γ-氨的亲核爆。在Mak1和AcbK活性亚基之以前推论到的过渡态与这一前提相符：日尔曼波蔗糖的O6A烷基处于理想位置，可以作为亲核醛并突袭AMP-PNP的γ-氨。与典改型丝氨酸激丝氨酸体一样，AcbK之以前Asp248的羧酸侧链（Mak1之以前的Asp247）将从O6A烷基之以前提取原子，Mn+2磁性镁与AMP-PNP的β-和γ-硫之以前心原子，将它们对齐以同步进行突袭（平面图3和扩大图注记平面图7）。在AcbK和Mak1晶体本体之以前，不可水解的ATP近似于；也AMP-PNP企图日尔曼波蔗糖的细胞内，并在氨集中于以前立即以过渡态有利于甘氨酸生成激丝氨酸体。在AcbK之以前，O6A-Pγ靠近为3.50 Å和日尔曼波蔗糖O6A亲核醛与AMP-PNP的Pγ和N3β原子黄绿色相交，以便将氨基团集中于到日尔曼波蔗糖（扩大图注记平面图7）。对于AcbK，His164（Mak1之以前的His162）与Mn+2镁之以前心原子，而Asp162（Mak1之以前的Asp160）与三个磁性生成水水分子之以前的两个成改型共价键（平面图3e和扩大图注记平面图7）。 与此前提相符，AcbK之以前的Asp248、Asp162和His164以及Mak1等同；也在所有试验的MAK之以前理论上保守（扩大图注记平面图7）。

我们为这三个甘氨酸实现了突变，并在Mak1的D247A、D160A突变和D160A/H162A双突变之以前推论到日尔曼波蔗糖细胞内活性分别减低713倍、7倍和300倍（扩大图注记平面图6和必需注记3）。最终，添加磁性螯合剂EDTA实际上扫除了原子化，确认了丝氨酸体的磁性特异性活性（扩大图注记平面图6）。这些深入研究注记明，这两种丝氨酸体采用相近的日尔曼波蔗糖细胞内前提，这近似于于先以前注记征的丝氨酸激丝氨酸体。平面图3. Mak1和AcbK的晶体本体看出了它们的本体类似于性和特定的日尔曼波蔗糖相互特异性甘氨酸。a，并列极其Mak1和AcbK与日尔曼波蔗糖甘氨酸和AMP-PNP生成以及之以前心原子磁性（Mn+2，深蓝色球形）极为类似于的本体。这两种胺基酸成改型典改型的丝氨酸激丝氨酸体卷曲，其之以前甘氨酸生成在两个主要碱基间的一个小裂缝之以前：核心α/β碱基和成改型单体应用程序的较小的β-扣合碱基。b，左平面图之以前，Mak1在两个小水分子间成改型具广泛相互特异性的除此以外单体，最特别是在的是一个小水分子的β3和另一个小水分子的β8（黄色显眼看出框；为了明晰起方知，每个小水分子的β-链用并不相同的边缘注记示）。请注意为水分子注记面视平面图（右侧），其之以前一个Mak1小水分子橙色为金色，另一个橙色为深蓝色，显眼看出了广泛的注记面积（1298 Å2）通过β-马蹄形碱基从外部参与成改型单体。c，Mak1甘氨酸生成貂的放大平面图，其之以前广泛的共价键网络与日尔曼波蔗糖A马蹄形之以前的所有烷基成改型，并将其实质上到位。看出了每个共价键的靠近。d，Mak1活性亚基的放大平面图，其之以前看出了重要的甘氨酸（Asp160、His162和Asp247），这些甘氨酸都从外部参与引发日尔曼波蔗糖的O6A烷基同步进行亲核爆，并促进硫从ATP（看出的AMP-PNP）集中于到日尔曼波蔗糖的O6A烷基。请注意的靠近都是O6A烷基到γ-硫的靠近。扩大图注记平面图7之以前备有了用于AcbK的对应的一小组平面图。

4 Mak1备有日尔曼波蔗糖抑止性

我们设计了一株黏膜黏性噬菌体菌种来注记达mak1，并将其在日尔曼波蔗糖长期存在下的多样锂水化合；也特异性发育与富含空载体解读的等基因组菌种同步进行了极其（深入研究方法）。我们选择黏膜黏性噬菌体有两个原因：mak1由具体的黏膜噬菌体同属天然装载（必需注记1），并且该菌种的遗传基因操作现在成功。在24 h和48 h的发育后，mak1的注记达造成了几种日尔曼波蔗糖剂量的特别是在发育维持（平面图4a，扩大图注记平面图8和必需注记6）。这些深入研究注记明，Mak1能够保护注记达它的生；也体免受日尔曼波蔗糖的锂水化合；也特异性发育抑止特异性的影响，这让人忆起通过失活造成了的抗药性性，尽管是对非抑止生素药；也的抗药性性。

平面图4. Maks的生；也学具体性和Mak1在本能黏膜有机体小组之以前的潜在缺少。a.24 h正常化生；也体发育，量度为600 nm时的光密度，以未有处置解读的百份注记示。条形平面图注记示对每种受试菌种常用并不相同日尔曼波蔗糖剂量的处置：注记达mak1（蓝色）的粘菌和富含空载体解读（灰色）的粘菌。mak1的注记达造成日尔曼波蔗糖的锂水化合；也特异性发育抑止活性在数据分析上特别是在维持。差值条注记示s.e.m.n = 4。采用断言不小于方差的两样品t检测同步进行统计深入研究* P 

5 mak载体与治疗法原子化

为了试验Maks对日尔曼波蔗糖的灭活断言确实会影响其治疗法视觉效果，我们深入研究了近期常用日尔曼波蔗糖同步进行的消化系统病理试验的图注记。虽然本研究在此之以前借以评估膳食纤维素对脾道有机体小组和抑止蔗乳癌治疗法的影响，但本试验的解读小组（U小组，16名病症）之外有数常用日尔曼波蔗糖治疗法84天而未有同步进行饮食干预的2改型蔗乳癌病症；在第0、28、56和84天收集尿液祥基因组小组基因组图注记和疾病具体生；也标记；也。我们将16名病症的尿液祥基因组小组基因组温度计给定到上述推测的21个mak和pmak基因组核苷酸上，以具体病症是mak感染性（在其有机体小组之以前区块任何mak或pmak）还是mak复数（在任何病症样品之以前除此以外未有监测到mak或pmak基因组）。常用该标准规范，一半病症被指出是mak感染性，而另一半被指出是mak复数，两小组病症间未女性或成年人并不相同（深入研究方法和必需注记7）。几周，我们检查了mak感染性和mak复数病症对日尔曼波蔗糖治疗法的原子化断言并不相同。像是的是，我们推论到两个病症小组在噬浆A1c（HbA1c）素质的百份巨大变化（治疗法后所有三个时间点）和空腹噬蔗糖素质（第84天；平面图4b，c）特别长期存在数据分析特别是在并不相同。当极其个数而不是百份巨大变化时，也推论到近似于的结果（扩大图注记平面图8）。

除此以外的是，这些并不相同遵循的模式与脾Maks—mak感染性病症之以前潜在的日尔曼波蔗糖失活相符，而这个模式与mak复数病症相比较，治疗法原子化逼近。尽管这些结果很有希望，但考虑试验之以前的样品量小以及许多其他病症内在各种因素确实在抑止蔗乳癌治疗法原子化之以前起特异性，应谨慎解释这些结果。

6 诱导日尔曼波蔗糖样水分子

本能黏膜有机体小组之以前区块日尔曼波蔗糖抑止性的基因组（99%的HMP旁观者的舌根上菌斑样品）有数有数不止，这使得我们断言该手部是日尔曼波蔗糖或日尔曼波蔗糖样水分子的诱导天然缺少。为了证明这一断言，我们从几个反之亦然的亚基因组小组或剥离基因组小组（深入研究方法）之以前小组装并注释了包涵mak基因组的基因组小组亚基，然后在相近的遗传基因邻域之以前查看近似于未有知日尔曼波蔗糖生；也还原丝氨酸体的区块胺基酸：3个未有知的日尔曼波蔗糖 BGC（acb、gac 和scat) 区块同一簇内的日尔曼波蔗糖激丝氨酸体。除此以外的是，我们推测一个有机体小组区块的BGC与gac极其类似于，并区块核心日尔曼波蔗糖生；也还原丝氨酸体的同系；也（平面图4d、扩大图注记平面图8和必需注记8和9）。

我们说是这种BGC顶端为诱导造成了的日尔曼波蔗糖样水分子或内锂蔗糖。end是在黏膜有机体小组的祥基因组小组支架之以前推测的，之外mak1（在end之以前区块时说是为endM）。根据其侧翼基因组计算end长期存在于黏膜噬菌体同属之以前（平面图4d、扩大图注记平面图8和必需注记1）。通过将3212份样品的祥基因组小组温度计给定到顶端，我们推测它只长期存在于黏膜有机体小组（HMP和Fijicomp之以前），并且与mak1近似于，它在舌根上菌斑样品之以前相当普遍。像是的是，对单个顶端基因组的深入研究注记明，它们可以长期存在于舌根上菌斑样品之以前的五种并不相同遗传基因背景（遗传基因变异）之以前：作为明晰的14基因组BGC（69/230，30%的HMP旁观者），作为退路的8基因组、4基因组或2基因组簇（除此以外之外mak1（endM）；分别在12%、7%和19%的HMP旁观者之以前），或作为独立自主的mak1基因组（在39/230之以前，17%的HMP旁观者之以前）。我们的深入研究还概述了几个一环顶端基因组覆盖不下并不相同的祥基因组小组样品，这与同一样品之以前有数两种基因组变体的共存相符（深入研究方法、扩大图注记平面图9和必需注记10）。end的推测、其与gac的惊人类似于性，以及end和mak1在舌根上菌斑样品之以前令人不快速的遗传基因背景注记明，抑止性基因组从本地内卡波蔗糖的值得注意合作社传布到同一生态系统位的非合作社。

发表意见

我们的推测有两个主要象征意义：首先，日尔曼波蔗糖样水分子的潜在诱导造成了，以及有机体小组的某些成员通过细胞内失活对这些水分子的影响的抵抑止概述了有机体竞争复合锂水化合；也的潜在前提。这让人忆起日尔曼波蔗糖在沙土马蹄形境之以前作为前提条件抑菌剂的假定生态系统特异性，并为本能有机体小第一组间锂水化合；也酪氨酸的相互特异性的多样网络减小了一个新的层面。其次，Maks的推测代注记了一个无意间但特别的有机体小组对非抑止生素、本能靶向药；也造成了抗药性性的例子，并概述了有机体小组-日尔曼波蔗糖相互特异性的病理重要前提。我们的本能病理试验图注记注记明，脾道有机体群之以前的mak装载确实影响抑止蔗乳癌原子化；更是是脾道特异性mak（mak16，由T. sanguinis区块）和常常在脾道之以前监测到的黏膜mak基因组（如黏膜噬菌体同属的mak1和mak5）往往由长期存在于小脾的生；也体区块，日尔曼波蔗糖的大部份治疗法特异性遭遇在小脾。初需要对脾道和黏膜有机体小组同步进行纵向祥基因组小组深入研究，并对大量长期服用日尔曼波蔗糖的病症同步进行详细的病理原子化评估，以明确评估装载mak基因组断言能计算有机体小组的巨大变化和/或治疗法视觉效果。

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